2024年1月8日，前沿交叉学科研究院生物学研究中心马三垣/夏庆友团队在《基因组研究》（Genome Research）上发表了题为“High-throughput and genome-scale targeted mutagenesis using CRISPR in a non-model multicellular organism, Bombyx mori”的研究论文，在家蚕个体水平首次构建了全基因组CRISPR文库，并对部分突变体进行了表型组学鉴定和功能筛选，获得了大量具有明显肉眼可见表型的突变体和具有潜在育种价值的候选基因。该研究为家蚕规模化功能研究和快速遗传育种提供了新的思路和平台。
该研究首先建立一套基于piggyBac双元编辑技术、混池文库载体、混池显微注射、混池遗传筛选的构建策略，该策略不但可以同时满足高效多用途遗传操作和保存生长缺陷系的要求，还可以大大降低工作量（图1）。在家蚕的全基因组中搜索所有外显子和转录起始位点上游约500bp，共发现3489264个sgRNA，择优选择92917个sgRNA（每个基因约8个外显子sgRNA和约2个启动子sgRNA），并在微阵列芯片上合成。通过PCR延长合成的sgRNA寡核苷酸库，连接到课题组之前构建的p200载体中以形成质粒库（p200-lib）。文库的深度测序显示，99.9%的设计sgRNA被成功克隆，超过97.4%的基因具有一个以上的sgRNA，99.9%的sgRNA具有36-4109个读数，表明p200lib具有足够的覆盖率、准确性和多样性。随后，该研究进行了大规模微注射。共注射了66650个胚胎，孵化出28300个注射胚胎并饲养成G0蛾。通过大规模荧光筛选，获得10332个G1蛾圈（约2000000个胚胎），1706个sgRNA阳性蛾圈，其中每个阳性蛾圈含有1-100个阳性sgRNA个体（图1）。
图1. 突变体库构建策略与过程（来自原文Figure 1）
在建立sgRNA品系库之后，该研究还从两个方面探究了该文库的用途。首先进行了突变体库的制备和表型组学鉴定。随机选择了300个sgRNA系与Cas9表达系杂交，对约150000个杂交后代进行饲养和筛选，获得40000个3Xp3-EGFP和IE2-EGFP双阳性信号的突变个体。为了确定编辑效率和模式，从每个品系中随机选择3-6只突变个体进行基因组靶位点测序。在1436只测试的蚕中，89.8%显示出可检测的编辑事件，超过64%的蚕显示出高于50%的编辑效率。对所有的个体进行表型组学观察和分析，发现300个F1品系中有33个在体型、表皮颜色、发育时间、斑纹特征、附肢发育和变态进程方面表现出显著的形态差异。将这些表型与相应的sgRNA和靶位点测序结果相关联，发现来自所有33个F1系的个体都具有正确的sgRNA，并且在靶位点具有高编辑效率。通过对300个突变系的经济性状进行测量和统计分析，发现了多个在茧层重、茧层率、雌雄比、茧型等具有显著差异的品系（图2）。其次，对于没有明显可见表型的突变体，开展了规模化混池遗传筛选实验。选取常见的环境污染物镉（Cd）进行非生物胁迫筛选，每个品系中选择了大约100个胚胎（1/4蛾圈），在正常人工饲料中混合饲养至3龄，然后给它们喂食含有30mg/kg CdCl2的人工饲料。CdCl2对野生型家蚕是致死的，因此混池中存活的蚕可能具有抗性，最终有53个个体存活到5龄。sgRNA测序显示，其中11只幼虫携带相同的sgRNA，靶向钙网织蛋白（KWMTBOMO12902），说明混池筛选的策略高效可行。对该基因进行了多个独立验证实验均显示其具有显著的抗性。此外，由于这是第一次大规模的获得个体水平的基因编辑数据，该研究还利用突变体检测过程中获得的大数据进行了分析，发现了影响sgRNA效率的可能因素，为后续sgRNA的优化设计提供了重要的线索。
图2. 突变体文库的表型组学分析（来自原文Figure 3）
自20世纪初以来，突变文库一直是生命科学创新和发现重大突破的主要手段，但是受限于技术的限制，突变体文库只在果蝇、拟南芥、小鼠等经典的模式生物中得到了成功的应用。该研究在课题组前期建立全基因组细胞编辑文库（于2020年发表于Genome Research）的基础上，利用CRISPR技术，突破了系列瓶颈，为家蚕功能基因组学提供了一种新的、通用的方法，并为识别关键候选基因提供了强大的资源，同时这一文库还为规模化快速育种提供了新的平台。该研究还证明了大规模突变文库在其他非模式生物中的有效性、实用性和便利性。
西南大学马三垣研究员为本文第一作者兼共同通讯作者，夏庆友教授为本文共同通讯作者，西南大学为第一完成单位。该研究受到国家自然科学基金优秀青年科学基金项目和重庆英才青年拔尖人才项目，以及重庆市科技局项目的资助。
全文链接：https://genome.cshlp.org/content/early/2024/01/08/gr.278297.123.abstract
文章来源：小青虫DBMediting